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图2. S11e在HT1080异种移植小鼠模型中的荧光成像
作者进一步通过将Cy5和Cy5标记S11e与纤维组织病理切片共同孵育 ， 发现正常组织中未见红色Cy5荧光信号 ， 良性肿瘤组织中可见轻微红色荧光信号 ， 恶性肿瘤组织中可见强红色荧光信号 ， 表明S11e在体外可以识别纤维肉瘤组织 。

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图3.S11e识别患者组织样本中的肿瘤细胞
3. S11e促进纤维肉瘤细胞凋亡并引起相关蛋白表达的改变
为研究S11e的生物学功能 ， 作者进行了细胞毒性实验 。 分别用S11e和Library （随机文库） 处理HT1080细胞后 ， 细胞活力分别为49.08%和93.42% ， 说明S11e而不是Library对HT1080细胞具有细胞毒性作用 。 综上所述 ， S11e可有效诱导HT1080细胞凋亡 ， 提示S11e对肿瘤细胞具有潜在的治疗作用 。

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图4. S11e或Library对HT1080和MRC-5细胞毒性分析
接下来 ， 作者利用Western blotting实验对S11e诱导HT1080细胞凋亡的途径进行了进一步探究 。 发现HT1080细胞与S11e孵育后 ， cleaved- caspase -9 (37 kDa)、cleaved- caspase -3 (17 kDa)和cleaved- PARP (89 kDa)的表达增加 。 当Caspase-9被激活时 ， Caspase-3被激活 ， Caspase-3进一步切割凋亡的关键酶PARP ， 直接诱导凋亡 。 这些结果表明 ， S11e特异性地通过线粒体介导的内源性凋亡途径诱导细胞凋亡 。

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图5. S11e或Library 处理后 ， HT1080细胞中凋亡蛋白的表达
4. Diablo/SMAC是S11e结合的功能性细胞蛋白
接下来 ， 作者探究了与S11e结合的功能性细胞蛋白 。有趣的是 ， 在S11e处理的细胞中特异检测到分子量为85 kDa和20 kDa的两条蛋白带 ， 而在Library处理的细胞中检测不到 。通过重点筛选分子量在15-25 kDa至70-90 kDa之间的蛋白 ， 然后用S11e与Library的评分比对其进行排序 ， 发现Diablo/SMAC (21 kDa)在凋亡触发后可以从线粒体膜间隙释放到细胞溶胶 ， 与其他攻击相比排名较高 。因此 ， 作者推测Diablo/SMAC是S11e的潜在结合靶点 。

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图6.S11e结合蛋白质谱分析
为证实上述推测 ， 作者使用三条独立的Diablo/SMAC特异性shRNA进行了功能缺失分析 ， 其中shSMAC 1和shSMAC 2对Diablo/SMAC干扰效果更加显著 。

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图7.Diablo/SMAC shRNA敲除效果
作者还对经S11e处理的Diablo/SMAC沉默的HT1080细胞进行了细胞划痕和侵袭实验 。 结果表明 ， SMAC的表达降低后 ， S11e对HT1080细胞迁移和侵袭的抑制作用被消除 ， 上述结果证实 ， SMAC是纤维肉瘤细胞中S11e的功能性结合靶点 。

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图8.Diablo/SMAC为S11e的功能结合蛋白
小结 综上所述 ， 本研究发现核酸适体S11e可以特异性识别纤维肉瘤细胞 ， 并且S11e能在HT1080异种移植小鼠模型和纤维肉瘤患者的肿瘤组织中识别肿瘤组织；同时发现S11e可以促进HT1080细胞的凋亡并抑制了HT1080细胞的迁移 。 此外 ， 确定了Diablo/ SMAC蛋白是S11e的细胞结合蛋白 ， 通过与S11e相互作用抑制HT1080细胞的迁移和侵袭 。