孔稀释法是通过数荧光的方法测定慢病毒滴度 ， 得到的结果为有感染能力的慢病毒颗粒数 。 下图是维真某慢病毒(3.20×108TU/mL)孔稀释法测滴度时的荧光图：

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维真生物采用2代慢病毒包装系统来制备慢病毒 。 该系统为三质粒系统 ， 包括1个包装质粒(psPAX2)、1 个包膜质粒(pMD2G)、1个目的基因质粒和1株包装细胞(293T cell) 。 下图是慢病毒制备流程示意图：
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1. 重组慢病毒的制备 Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs ， 第二天细胞汇合度达到90%-95%（~ 1.5×108/dish） ， 培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS） 。
Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；
2)按照以下比例配制转染试剂：
Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μg
Mix 1和Mix 2分别混合后 ， 室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合 ， 室温30min ， 加入至15cm dish中 。 （细胞达到汇合度90% ， 细胞过少会影响转染效率）
Day3:6h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS） ， 观察转染效率并拍照 。
Day5:72h观察细胞状态并拍照 。 收取上清培养基 ， 过0.45μm滤膜 ， 上清培养基加入超速离心管中 ， 配平后离心 ， 25000rpm ， 4℃离心1.5h 。 弃上清 ， 用适当病毒保存液回溶混匀溶解过夜 。
Day6：收集病毒分装 ， 进行病毒滴度测定 。
2. 重组慢病毒滴度测定 2.1 整合数法标定不带荧光的重组慢病毒滴度
2.1.1 病毒感染细胞
①感染前6 h 在24孔细胞培养板中以2.5×105个细胞/孔 均匀接种HEK293细胞 。
②将慢病毒进行梯度稀释 ， 共做3个梯度 ， 即每孔（500μl 无双抗、无血清的DMEM培养基）中含10 μl、1 μl、0.1 μl 病毒 ， 振荡混匀后加至接种好细胞的24孔板中 ， 加病毒之前将培养板中的培养基吸净 。
③感染 18-20h 后 ， 将培养板中的培养基更换为新鲜的DMEM完全培养基 。
④感染 64-68h 后收集细胞并进行基因组DNA的提取 。
⑤测定时 ， 设置一组带荧光的已知TU的慢病毒作为对照 ， 以校验检测出的数值 。
2.1.2 提取基因组DNA（按照AxyGEN 的基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作）
2.1.3 qPCR检测
① 以被测慢病毒载体梯度稀释为标准品 ， 慢病毒载体上的通用引物进行qPCR以获得病毒整合拷贝数 。
② 以Actin质粒梯度稀释为标准品 ， Actin引物进行qPCR检测样品的基因组拷贝数以得到基因组拷贝数 。
③ qPCR
qPCR反应体系如下：
组成成分体积2 × SYBR Green mix10 μlPrimers (Forward & Reverse mixture)0.8 μl超纯水（DNase & RNase Free）7.2μl模板2μlTotal20μl
qPCR反应程序：
循环参数预变性95℃3min95℃5S60℃15S72℃15S+Plate Read39个循环
2.1.4 计算慢病毒IU（Integration Unit）ml-1
IU ml-1=(C×N×D×1000)/V
注：C=平均每基因组慢病毒整合拷贝数D=病毒的稀释倍数N=感染时细胞的数目（约为2.5×105）V=加入稀释病毒的体积数
2.2 孔稀释法标定带荧光的重组慢病毒滴度
Day1:细胞的准备
在96孔板中的每个孔中接种1-4×104个 HEK293细胞 。
Day2:病毒的稀释与感染
在Eppendorf管中做10倍梯度稀释 ， 分别是1~10-6梯度 。 弃去96孔板中原有的培养基 ， 将稀释好的病毒依次加入孔中 ， 注意是两个重复 ， 并做好标记 。
实验预览如图：