荧光标记方法实时荧光定量 PCR 荧光标记方法可分为荧光染料和荧光探针两类，染料类荧光定量 PCR 是利用与双链 DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加；探针类荧光定量 PCR 是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加 。  
荧光染料  
染料法荧光定量 PCR 是利用荧光染料与双链 DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加 。现以最常用的SYBR GreenⅠ为例，介绍染料法荧光定量 PCR 的工作原理：  

  
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图 3：荧光染料法原理  
SYBR GreenⅠ是一种荧光染料，可与双链 DNA 非特异性结合 。在游离状态下，SYBR Green Ⅰ发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA 结合，其荧光增加 1000 倍 。一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链 DNA 量呈比例，且会随扩增产物的增加而增加，可通过荧光信号的增加来记录产物的增加 。  
荧光探针  
探针为一段寡核苷酸，可与 DNA 序列特异性结合，一个模板结合一个探针 。探针 5’端具有报告基团（R），可发荧光；3’端有荧光淬灭基团（Q），能吸收荧光 。探针完整时 R 基团所发射的荧光能量被 Q 基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号 。探针被酶水解后，R 与 Q 分开，PCR 仪可检测到荧光信号 。  
Taq 酶有 5’→3’外切核酸酶活性可水解探针，在 PCR 延伸阶段探针被 Taq 酶酶切降解，报告基团（R）与淬灭基团（Q）分离，荧光监测系统可接收到荧光信号 。每扩增一条 DNA 分子，释放一个荧光信号，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步 。  
  
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图 4：探针原理  
目前已经开发出来的探针有 Taq Man 探针、Taq man MGB 探针、双杂交探针、分子信标、Lux 杂交探针、Simple proble 探针等 。  
探针法与染料法对比  
  
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荧光定量 PCR 应用实时荧光 PCR 技术已广泛应用于临床及生命科学研究的各个领域中 。在科研方面可定量分析各种基因的表达分析，基因突变和多态性分析，单核苷酸多态 SNP 测定及易位基因的检测；在医疗方面可用于免疫组化分析、临床疾病早期诊断、病原体检测、耐药性分析、肿瘤微小残留病变研究等 。（转自先达基因 www.gendx.cn）  
【pcr过程图 pcr过程图解第四轮】  
  
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