二,甲基化酶
在专一位点上甲基化,与限制性内切酶相对应.
(一)大肠杆菌中的甲基化酶
dam甲基化酶: 可在5\’GATC3\’序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,这样可使一些识别顺序中含有5\’GATC3\’的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl I(TGATCA),但BamH I(GGATAA)则不会因为N6A的甲基化而失去活性,因为这两种酶对底物的特异性不同.
dcm甲基化酶 此酶在序列5\’CCAGG3\’或5\’CCTGG3\’中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影响的限制性内切酶是EcoR II.
(二) 甲基化酶在基因工程中用途
许多II类限制性内切酶,都存在着相对的甲基化酶,它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上,封闭酶切位点,从而使其免受切割.如:M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上,从而使DNA免受EcoRI的切割.
三,T4-DNA连接酶(T4-DNA Ligase)
来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌,连接修复3\’端羟基和5\’端磷酸基因,脱水形成3\’-5\’磷酸二酯键
连接双链DNA上的单链缺口(Nick),因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端
连接RNA模板上的DNA链缺口
连接平头双链DNA速度很慢,在高浓度的底物和酶的作用下方可进行,这属于分子之间的连接.
图2-2 连接酶的作用方式
四,核酸酶
作用: 降解磷酸二酯键
分为:外切酶 内切酶
(一) Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性,双链特异的内切酶活性.依赖于Ca2+
用途:
构建限制酶图谱
产生末端缺失突变
DNA超螺旋线性化
(二)E. coli外切酶III
只降解DNA分子的一条链,产生单链的DNA分子.
(三)S1核酸酶(来源于米曲霉菌)
特性:
1. 降解单链DNA或RNA,降解DNA的速度大于降解的速度
2. 降解发生的方式为内切和外切
3. 酶切活性需4.0-4.5pH环境,Zn2+激活
4. 酶量过大时会降解双链核酸,因为双链降解活性比单链低75000倍
(四) DNase I: 来自于牛胰腺, 既可以降解单链也可以降解双链,没有特异性,产生单核苷酸或短链
五,聚合酶
(一)DNA聚合酶I
5\’-3\’聚合酶活性
3\’-5\’外切酶活性
5\’-3\’外切酶活性
核酸内切酶活性
可以被枯草杆菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5\’-3\’外切酶活性的分子.
图2-3 DNA聚合酶I
(二) Klenow酶
该酶无5\’-3\’外切活性,保留了5\’-3\’聚合活性及3\’-5\’外切活性,基因工程中利用该酶:
修复限制性内切酶造成的5\’突出的粘性末端
标记DNA探针
催化cDNA第二条链的合成
末端终止法测序
图2-4 Klenow 酶的作用方式
(三) T4 DNA聚合酶
与Klenow酶相似,外切酶活性更高.体外诱变反应中效率很高.
(四)T7 DNA聚合酶
测序酶
(五) Taq DNA聚合酶
耐高温,主要用于PCR反应.
(六) 逆转录酶:将mRNA转录成cDNA
AMV逆转录酶(鸟类成髓细胞性白血病病毒)
DNA聚合酶活性
RNase H活性
DNA内切酶活性
核酸结合活性
M-MLV逆转录酶(Moloney鼠白血病病毒)
两种逆转录酶的区别
肽链的组成
禽酶2条肽链,具聚合酶和很强的RNase H活性
鼠酶1条,较弱的RNase H活性
反应的最适温度
禽酶42°C,二ji结构丰富RNA,禽酶效率高
反应的最适pH值
【构建重组质粒时，只能用同一种限制酶切割目的基因和载体吗？】禽酶pH 8.3
鼠酶pH 7.6
六,DNA修饰酶
有大量的修饰酶,主要的有以下几种:

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