1) 碱性磷酸酯酶(来自于大肠杆菌或小牛肠道)可以去掉DNA分子的5\’端的磷酸基团.
2) polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌,在5\’端增加磷酸基团.
3) 末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl tansferase) 来自于小牛胸腺组织,在DNA分子的3\’端增加一个或多个脱氧核苷酸.
4) Topoisomerase改变共价闭合双链DNA分子的结构
第二节 DNA的切割反应
一,缓冲系统的组成
II类酶的酶活条件:Tris-HCl PH7.5, 25-50mM;10mM MgCl2 ;NaCl 0-150mM; DTT 1mM
根据不同酶对盐离子要求不同,可将缓冲液分为以下三种情况:
高盐:100-150mM
中盐:50-100mM
低盐:0-50mM
二,酶切操作
DNA量的确定,加入酶量的确定,发应体积的确定(20μl),反应时间的确定,1-1.5hr,一般为37℃,但也有例外,如Taq I在65°C时活性最高.
单位限制性内切酶定义为:在最佳缓冲系统和20μl体积中反应1小时,完全水解1μgDNA所需的酶量.
三,酶切结果分析
(一) 酶切片段的检测
1) 通过凝胶电泳分离,根据分子量分离.根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段,聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子.
2) DNA分子的检测 a. 染色EB,DNA分子小于25ng,很难检测到
b. 放射性自显影, 可以监测少到2ng DNA分子.
(二)估计DNA分子的大小
根据DNA分子的迁移率,可以用公式计算出分子量D=a-b(logM)
D是移动的距离,M是分子量,a, b是恒量但随着电泳条件的改变而改变.
也可以根据已知大小的片段进行比较,误差约在5%左右.
四,多酶联合酶解
对于对浓度要求相同的酶,原则上可以同时酶解;
对于对浓度要求不同的酶,可以:
1. 低盐浓度的酶先切,后补加NaCL
2. 一种酶切后,换缓冲液,加5mM NaAc 0.1体积,2体积乙醇,冰浴5min,4℃离心10min,干燥
五,定位酶切位点
建立酶切图谱需要一系列的酶.
首先确定每一种酶切后产生的分子量和片段的数目;
然后进行双酶切;
比较酶切和双酶切的结果,绘制酶切图谱;
含糊的位点可以通过部分酶切解决,可以短时间的酶切或者在4°C条件下进行.
六, 限制性内切酶的star活性
在PH不合适,或甘油浓度过高≥10%时,限制性内切酶的切割位点会出现非专一性,因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下.
第三节 DNA片段的连接
重组DNA分子构建的最后一步是连接,通过连接酶完成.相对而言,钝端的连接效率较低,因此一般提高DNA浓度的方法增加接触的机会.而粘性末端的连接效率较高,因为两个粘性末端可以通过氢键碱基互补配对.这种暂时的,碱基配对结构可以提高连接的效率.在分子克隆的连接方式主要有以下几种:
一,连接方式
(一)相同粘性末端的连接
来源:
相同的酶
同尾酶
问题:
极性有两种可能
同尾酶连接后,不能用任何一种酶酶切.称为\”焊死\”.
(二)平头末端的连接
粘性末端–分子内部连接,平头末端–分子间的连接.
提高连接效率的方法:
加大酶用量(10倍)
加大平头末端底物的浓度
加入10%PEG(8000),促进分子间的有效作用
加入单价阳离子, 150-200mM NaCl
提高反应温度
平头连接同样存在两种极性
(三)不同粘性末端的连接
突出5\’末端
Klenow补平,或S1核酸酶切平,然后平头连接
突出3\’末端
T4-DNApol切平,然后平头连接
突出末端不同
Klenow补平,或S1核酸酶切平
连接后,可能恢复限制性位点,甚至还可能产生新的位点.XbaI与HindIII( XbaI恢复), XbaI与EcoRI(均保留),BamHI与Bgl II(产生ClaI位点)

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