当然不是一种了，我们可以根据需要和实际情况来自己选择 。

文章插图
首先，在构建重组质粒的时候，我们首先得了解所用的质粒多克隆位点有哪些切割位点 。这个可以通过查询载体的图谱来查看只要图谱中有的位点，那都是可以用相应的限制酶来进行切割 。一般不要使用平末端的酶切位点，因为结合效率比较低 。除了特殊情况，才会选择平末端位点 。
其次，我们要了解哪些酶切位点是比较常用的，哪些成功率高，效率高 。然后检查我们的目的基因内部中是否存在这些酶切位点 。如果基因内部含有你想用的酶切位点，那就需要更换，不然会把目的基因切割掉 。那就更换其他的，反正就在常用的酶中选择两个，同时要避免基因内部含有酶切位点 。关于这个，可以通过软件去分析，最常用的就是DNAstar，使用很简单，功能很强大 。
最后就是设计引物，在设计引物的过程中，需要把上下游引物两端添加上你选择好的酶切位点 。通过引物去扩增目的基因，同时，带上了酶切位点 。这里需要注意的是，在添加酶切位点的时候，一定要把上下游搞清楚，初学者是有可能看反上下游的 。
基因工程研究中需要哪几类酶，这些酶各有什么作用？用于基因工程的工具酶
一,限制性内切酶(Endonucleosase)
(一)限制性内切酶(Endonucleosase)的发现与分类
1) 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断,从而保证其不为外来噬菌体所感染,而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护,这种现象叫做限制-修饰,它们由三个基因位点所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年后,人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理:
hsd R—限制性内切酶
hsd M—限制性甲基化酶
hsd S—控制两个系统的表达
1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶,Hind II和Hind III,为基因工程技术的诞生奠定了基础.
截止到目前为止,已经分离出400余种II类酶,搞清识别位点的有300种,商品化的约有一百种,而实验室常用的有二十种 .
2)限制性核酸内切酶可分为三大类:
I类 能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近切割双链,但切割序列没有专一性.
II类 识别位点(回文序列)严格专一,并在识别位点内将双链切断
III类 识别位点严格专一(不是回文序列),但切点不专一,往往不在识别位点内部.
因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶.
(二)II类限制性内切酶的命名及特性
命名原则:取属名的diyi个字母大写,取种名的前两个字母小写,构成基本名称.该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等.如存在变种和品系,取变种或品系的一个字母.若酶存在于质粒上,则需大写字母表示非染色体遗传因子.
如,HindIII从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶.EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上.
(三)II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点
绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别顺序长度为4,5,6碱基对,这些碱基对的顺序呈回文结构(Palindromic),而且切点就在其内部,如EcoRI 5\’-GAATTC-3\’ .
DNA被限制性内切酶切开之后,呈现两种断口:
钝端(平端)如Pvu II, Alu I, EcoR V等
粘端(粘性末端)如:EcoR I等
图2-1 限制性内切酶产生的末端
(四)识别位点在DNA分子中的频率
对于特定的限制性酶在DNA分子中的识别位点数目是可以计算的,四碱基的酶平均大约每256个核苷酸(44)有一个识别位点,而六碱基的酶大约4096(46)个核苷酸有一个识别序列,计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的.实践中这种方法不完全正确,如λ DNA长49kb,对于六碱基的酶应该有12个切割位点,实际上要少一些,如Bgl II只有6个,BamHI只有5个,而SalI只有2个.

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