Gene Set Enrichment Analysis (基因集富集分析)用来评估一个预先定义的基因集的基因在与表型相关度排序的基因表中的分布趋势，从而判断其对表型的贡献 。其输入数据包含两部分，一是已知功能的基因集 (可以是GO注释、MsigDB的注释或其它符合格式的基因集定义)，一是表达矩阵 (也可以是排序好的列表)，软件会对基因根据其与表型的关联度(可以理解为表达值的变化)从大到小排序，然后判断基因集内每条注释下的基因是否富集于表型相关度排序后基因表的上部或下部，从而判断此基因集内基因的协同变化对表型变化的影响 。
(The gene sets are defined based on prior biological knowledge, e.g., published information about biochemical pathways or coexpression in previous experiments. The goal of GSEA is to determine whether members of a gene set S tend to occur toward the top (or bottom) of the list L, in which case the gene set is correlated with the phenotypic class distinction.)
这与之前讲述的GO富集分析不同 。GO富集分析是先筛选差异基因，再判断差异基因在哪些注释的通路存在富集；这涉及到阈值的设定，存在一定主观性并且只能用于表达变化较大的基因，即我们定义的显著差异基因 。而GSEA则不局限于差异基因，从基因集的富集角度出发，理论上更容易囊括细微但协调性的变化对生物通路的影响，尤其是差异倍数不太大的基因集 。
给定一个排序的基因表L和一个预先定义的基因集S (比如编码某个代谢通路的产物的基因, 基因组上物理位置相近的基因，或同一GO注释下的基因)，GSEA的目的是判断S里面的成员s在L里面是随机分布还是主要聚集在L的顶部或底部 。这些基因排序的依据是其在不同表型状态下的表达差异，若研究的基因集S的成员显著聚集在L的顶部或底部，则说明此基因集成员对表型的差异有贡献，也是我们关注的基因集 。

文章插图

GSEA计算中几个关键概念：

1. 计算富集得分 (ES, enrichment score). ES反应基因集成员s在排序列表L的两端富集的程度 。计算方式是，从基因集L的第一个基因开始，计算一个累计统计值 。当遇到一个落在s里面的基因，则增加统计值 。遇到一个不在s里面的基因，则降低统计值 。
2. 每一步统计值增加或减少的幅度与基因的表达变化程度（更严格的是与基因和表型的关联度，可能是fold-change，也可能是pearson corelation值，后面有介绍几种不同的计算方式）是相关的，可以是线性相关，也可以是指数相关 （具体见后面参数选择） 。富集得分ES最后定义为最大的峰值 。正值ES表示基因集在列表的顶部富集，负值ES表示基因集在列表的底部富集 。
3. 评估富集得分(ES)的显著性 。通过基于表型而不改变基因之间关系的排列检验 (permutation test)计算观察到的富集得分(ES)出现的可能性 。若样品量少，也可基于基因集做排列检验 (permutation test)，计算p-value 。
4. 多重假设检验校正 。首先对每个基因子集s计算得到的ES根据基因集的大小进行标准化得到Normalized Enrichment Score (NES) 。随后针对NES计算假阳性率 。（计算NES也有另外一种方法，是计算出的ES除以排列检验得到的所有ES的平均值）
5. Leading-edge subset，对富集得分贡献最大的基因成员 。

本文通过总结多人学习使用过程中遇到的问题进一步记录软件操作过程和结果解读，力求讲清每个需要注意的细节点 。
从前文中我们了解到GSEA分析的目的是要判断S集基因（基于先验知识的基因注释信息，某个关注的基因集合）中的基因是随机分布还是聚集在排序好的L基因集的顶部或底部（这便是富集分析） 。

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