2.2 rAAV shRNA克隆服务
维真生物为您提供了多种表达shRNA的rAAV ， 包括U6或H1启动子和作为哺乳动物表达标记的GFP或RFP 。 同时 ， 也可根据您感兴趣的基因提供shRNA设计服务 。
2.3 rAAV载体容量
腺相关病毒载体能够感染分裂和非分裂细胞 。 毒性和免疫原性低 ， 适合以相对较高的转染效率在非分裂细胞中长期表达和在分裂细胞中短期表达基因 。 但AAV载体的外源基因容纳量有限 ， 两个ITR之间的空间只有4.9kb ， 因此可插入的外源基因为3.5kb甚至更小 。 请参阅本表选择适合您的病毒载体系统 。

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腺相关病毒颗粒生产流程
第一步：基因克隆 。 将外源基因克隆进入维真生物公司的人源或shRNA腺相关病毒载体 ， pAV-FH AAV等载体的多克隆位点与我们的human ORF穿梭克隆相兼容 ， 非常适于哺乳动物ORF的表达 。
第二步：细胞转染 。 将携带外源基因的重组质粒与辅助质粒Ad Helper Vector和pAAV-rep/cap Vector共转染进入HEK293T细胞 ， 感染72h之后即包装完毕 。
第三步：收毒 。 分别收获培养基上清与细胞沉淀 ， PEG8000沉淀培养基上清中的病毒 ， 培养基上清先用0.45um滤膜过滤 。
第四步：病毒纯化 。 通过碘克沙醇法对病毒进行纯化 ， 一方面提高病毒滴度 ， 另一方面某些动物实验需要纯化之后才可进行 。
第五步：滴度检测 。 用QPCR的方法来检测病毒的滴度 ， 得到的结果为包装得到的病毒颗粒数 。
维真生物的pAV-FH AAV载体 ， 具有Amp抗性、CMV启动子 ， 带有Flag-His标签 。 多克隆位点与维真生物的human ORF穿梭克隆相兼容 。 非常适于哺乳动物ORF的表达 。 维真生物为您提供了多种表达shRNA的rAAV ， 包括U6或H1启动子和作为哺乳动物表达标记的GFP或RFP 。 同时 ， 也可根据您感兴趣的基因提供shRNA设计服务 。
pAAV-rep/cap质粒（图）包含AAV编码复制蛋白和病毒衣壳蛋白的rep和cap基因 ， 获得期望的高滴度病毒产品的关键基因 。
pHelper 质粒（图）包含AAV-HEK293T 生产高滴度病毒必须的的腺病毒基因VA ， E2A 和E4 的集合 。 提供AAV 生产所必需的腺病毒蛋白质E1A 和E1B 在HEK293T 细胞中稳定表达 。
生生产流程示意图
1.腺相关病毒重组克隆构建
1）根据订单不同选择不同的载体 ， 在此以人源基因克隆为例 。
2）维真生物公司的AAV载体与我们的人源ORF库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容 ， 通过酶切 ， 连接 ， 转化的方式将基因亚克隆进入pAV-FH AAV载体 ， 得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验证及测序以确认插曲片段的正确性 。
2.细胞冻存流程
1)按照培养细胞流程 ， 将细胞吹下来加入50ml离心管中 ，800g离心5min 。
2)配制冻存液 ， 90% 血清 ， 10% DMSO ， 混匀 。
3)离心后去上清 ， 将配制的冻存液加入 ， 将细胞吹匀
4)取上述溶液1ml分至1.5ml细胞冻存管中 ， 做好标记和日期 。
5)放入装有异丙醇的冻存盒中 ， 放入-80度冰箱过夜 。 （冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温 ， 使异丙醇的温度达到室温 ， 每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上） 。
6)第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中 。
3.细胞复苏流程
1)10cm培养盘中加10cm新鲜DMEM培养基 ， 放培养箱预热至37℃ 。
2)从液氮中取出冷冻管 ， 迅速投入37 ℃ ～38℃水浴中 ， 使其融化（1-2分钟左右） 。
3)待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加入预热的培养盘中 。
4)摇晃均匀 ， 放培养箱培养 。