5)4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基（除去冻存液中DMSO对细胞的毒害作用 。 也可在第3步中800g离心5min ， 除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的DMEM细胞培养皿中） 。
4.细胞培养流程（以10cm细胞培养皿 ， 传代为例）
1)生物安全柜紫外灭菌半小时 。
2)灭菌期间 ， DMEM培养基(含10%FBS ， 1%青链霉素混合液)、PBS以及0.25%胰酶在37℃水浴锅中预热 。
3)取汇合度接近100%活性好的的HEK293T细胞 ， 吸弃培养盘中培养基 ， 加约5ml ， 1 ×PBS ， 摇晃几下 ， 吸弃PBS 。 （加PBS目的主要除去残留在皿中的培养基中的FBS ， 以提高胰酶的消化效率）
4)加1ml 0.25% 胰酶在生物安全柜内消化约1min ， 室温低时可放置于培养箱中消化 。 消化时间不宜过长 ， 否则影响细胞再次贴壁效率和活性 。
5)加入约5ml的预热的培养基 。
6)用移液管吹打均匀 ， 按照1:3比例传代 。 各洗2ml培养基至新的10cm皿中 ， 再加入8ml预热的DMEM培养基 。 （吹打过程中不可用力过大 ， 否则会吹破细胞） 。
注意：传代盘数较多时 ， 要先将预热的DMEM培养基加入到10cm皿中 ， 再加入含细胞的培养基 ， 以避免细胞分布不均 。 放置于培养箱前轻轻混匀皿中的培养基 ， 使细胞均匀分散于培养基中 。 细胞培养条件为5%-7%CO2浓度 ， 37℃ ， 培养箱内无菌水盘内水份提供一定的湿度 。
细胞传盘以及分6孔板 ， 24孔板 ， 96孔板分细胞都经过上述流程 ， 只是细胞数与分的比例不同 ， 具体情况具体操作 。
5.AAV 病毒包装
以10cm细胞培养皿为例
第一天: 聚合度90%以上的HEK293T细胞按1：3比例传盘（每盘大约2.5 x 106） ， 培养基Hyclone高糖DMEM培养基（含10%FBS） 。
第二天: 转质粒前1-2h左右 ， 换成无血清培养基（所有血清型AAV） ， 用转染试剂将目的基因质粒和辅助质粒（需用酚氯仿提取的质粒）转入HEK293T中 。
第三天：质粒转化24h后 ， 换新的无血清培养基（所有血清型AAV）
第五天：转染72h收毒 。 带着培养基 ， 吹下细胞 ， 离心；然后分别收获培养基上清与细胞沉淀 。 用PEG8000沉淀培养基上清中的病毒 ， 沉淀过夜后收集病毒沉淀 。
6.AAV病毒纯化
1)收集病毒沉淀和细胞沉淀 。
2)细胞沉淀-80℃保存 ， 后续实验用 。
3)破碎细胞 。
4) 将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化 。
7.病毒浓缩
用超滤管进行浓缩 。
8.病毒滴度检验
1)腺性相关病毒处理破除AAV病毒外壳， 37 ℃ 孵育30 min ， 然后加热 95 ℃5 min 使酶失活 ， 体系如下：
组成成分
体积
病毒液
5ul
蛋白酶K（5ug/ul）
1ul
超纯水
4ul
2)离心12000rpm,2min.取上清 。
3)标准品的拷贝数 ， 7个梯度稀释浓度分别：7.2E+8V.G./UL,7.2E+7V.G./UL,7.2E+6V.G./UL,7.2E+5V.G./UL,7.2E+4V.G./UL,7.2E+3V.G./UL,7.2E+2V.G./UL.并将超纯水作为阴性对照 。
4)配制PCR反应体系 ， 每个样品20 ul体系 ， 体系如下：
组成成分
体积
2X SYBRGreen缓冲液
10ul
F、R引物混合物
0.8ul
超纯水
7.2ul
病毒样品或标准品
2ul
5)PCR反应体系
组成成分
体积
95℃
5min；
95℃
15sec
60℃
15sec
72℃
15sec
40个cycles
6)病毒颗粒数公式：病毒颗粒数（个/ml）= 与标准品相对值 × 1000
腺相关病毒感染目的细胞预实验
以2型AAV病毒为例 ， 维真生物为您推荐的MOI值10000:1-100000:1 ， 是根HEK293T细胞得出的数据 ， 不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同 。 建议您感染目的细胞前 ， 进行预实验摸索最佳MOI值 ， 推荐使用有荧光的对照病毒来摸索条件 。